El mecanisme d'acció és la inhibició de la síntesi de proteïnes mitjançant la unió a la subunitat ribosòmica 30S dels microorganismes susceptibles a
oxitetraciclina, per tant
impedint la connexió entre els ribosomes i l'aminoacil-ARNt. També es creu que l'oxitetraciclina es connecta inversament amb els ribosomes 50S i canvia la permeabilitat de la membrana citoplasmàtica dels microorganismes sensibles. L'oxitetraciclina, a altes concentracions, també pot inhibir la síntesi de proteïnes a les cèl·lules.